Informe final del proyecto: Un estudio sobre la genética, actividad y estructura de cannabinoides sintasas en Cannabis.

Abstract

El hombre ha usado Cannabis desde hace más de ocho mil años, atraído por sus cualidades como fuente de fibras, aceites, granos, sustancias medicinales y sustancias psicoactivas. Esta larga historia de la planta junto al hombre y su continua selección, sumado al hecho de que es una especie principalmente dioica, polinizada por el viento (lo cual favorece la hibridación), con un ciclo de vida corto, han hecho que en la actualidad existan cientos de variedades de Cannabis, ya sea silvestres o seleccionadas según el uso que se le quiera dar. Las plantas de Cannabis poseen un metabolismo secundario extremadamente rico en donde los cannabinoides tienen un papel protagónico. De los más de 120 cannabinoides descritos para Cannabis, el ácido delta-9-tetrahidrocannabinólico (THCA) y el ácido cannabidiólico (CBDA), junto con sus formas oxidadas (THC y CBD, respectivamente) son los más abundantes y estudiados, seguidos por el ácido cannabicrómico (CBCA) y el ácido cannabigerólico (CBGA), y sus formas oxidadas CBC y CBG. Todos estos cannabinoides son únicos de Cannabis, ya que no se han encontrado en ninguna otra especie. Hace más de cincuenta años se sabe que el THC es responsable del efecto psicoactivo de Cannabis, pero debido a las prohibiciones ha sido muy poca la investigación en este tema. Ha sido recién a finales del siglo XX, con el descubrimiento del Sistema Endocannabinoide animal, que se ha producido un cambio en la concepción sobre la investigación en cannabinoides y su efecto en humanos. Como consecuencia de las investigaciones recientes, actualmente el THC se usa, por ejemplo, para aumentar el apetito en pacientes con SIDA o como antiemético en pacientes bajo quimioterapias. El CBD es muy conocido por su propiedad anticonvulsiva demostrada en ensayos clínicos. De hecho, en 2018, la FDA aprobó el uso de CBD para el tratamiento de convulsiones en pacientes epilépticos. Además, el CBD posee otras propiedades terapéuticas como ansiolítico, antidepresivo, antipsicótico, anti-náuseas, antioxidante, antiinflamatorio, anti-artritis y antineoplásico. Se ha visto que el efecto de Cannabis difiere del de THC puro en que la planta mitiga efectos secundarios del THC (como disforia, taquicardia, ansiedad y pánico) o mejora sus efectos en algunos casos. Otros cannabinoides y terpenos producidos por Cannabis jugarían un papel en esta marcada diferencia (a lo que se denomina “efecto séquito”). Los diferentes usos y efectos de los cannabinoides suscitan un gran interés por entender que factores determinan que Cannabis favorezca la síntesis de un cannabinoide frente a otro y el nivel de su producción. Hallazgos que permitan identificar los factores que determinan que Cannabis produzca un cannabinoide frente a otro, ayudarían a la selección de variedades de Cannabis con características adecuadas para uso terapéutico, así como a dirigir y acortar los procesos de selección de variedades a nivel agronómico e industrial. En este proyecto hemos generado herramientas moleculares e información que ayudarían en este sentido. Al estudiar cómo Cannabis prioriza la síntesis de THCA frente a CBDA, hay que tener en cuenta que THCA, CBDA y CBCA son sintetizados por tres enzimas que utilizan un mismo sustrato, el CBGA. Estas enzimas son la THCA sintasa (THCAS), la CBDA sintasa (CBDAS) y la CBCA sintasa (CBCAS). Así, la producción de los cannabinoides mayoritarios, THCA y CBDA, está determinada por la actividad relativa de las enzimas THCAS y CBDAS en la planta, la actividad de la CBGA sintasa (CBGAS) que produce el sustrato para THCAS, CBDAS y CBCAS, así como la actividad de la CBCAS ya que ésta puede competir por el CBGA y disminuir su disponibilidad. Estudios previos muestran que Cannabis puede tener más de un gen que codifica para cada una de estas enzimas, habiendo mucha confusión sobre cuantos genes hay en el genoma y cómo se regulan estos genes. Aquí nos propusimos estudiar el comportamiento de los genes que codifican para THCAS, CBDAS, CBCAS y CBGAS en diferentes variedades de Cannabis, con el fin de identificar factores genéticos que puedan influir sobre la síntesis de THC, CBD y CBC. Para este estudio, las muestras estudiadas fueron donadas por autocultivadores registrados en el IRCCA y comprenden variedades ricas en THC, ricas en CBD y THC:CBD balanceado. Los genes que codifican para THCAS, CBDAS y CBCAS poseen un altísimo porcentaje de identidad (90-96%), son extremadamente parecidas a nivel de su secuencia de ADN, esto dificulta mucho su estudio a nivel molecular ya que son muy difíciles de distinguir las unas de las otras. Esto ha generado mucha confusión durante mucho tiempo sobre la identidad de los genes, su presencia en los genomas y su expresión. En este proyecto hemos logrado desarrollar un método que permite detectar de forma específica a los genes relacionados con THCAS, CBDAS, CBCAS y CBGAS en los genomas de Cannabis, distinguiendo unos de otros y permitiendo cuantificar el número de copias de estos genes en los genomas de variedades de Cannabis. Este método nos ha permitido mostrar que todas las variedades estudiadas, independiente de si producen THC o CBD, poseen una copia del gen CBGAS. Mostramos que las variedades ricas en THC tienen un solo gen que codifica para THCAS (el equivalente a una copia en cada cromosoma) y este se expresa en altas cantidades en flores femeninas, mientras que no poseen el gen que codifica para CBDAS. Esto explica el fenotipo químico de las plantas (ricas en THC y sin CBD). De forma análoga, pudimos mostrar que las variedades ricas en CBD poseen el equivalente a una copia en cada cromosoma del gen que codifica para CBDAS, que se expresa en altas cantidades en flores femeninas, y que no poseen el gen que codifica para la THCAS. La variedad THC:CBD balanceada estudiada mostro tener el equivalente a un gen que codifica para THCAS en un cromosoma y un gen que codifica para CBDAS en el otro cromosoma, expresándose ambos de forma similar en flores femeninas. Esto explica el fenotipo químico descrito en donde la planta produce cantidades equivalentes de THC y CBD. Con el mismo método pudimos determinar que las diferentes variedades poseen un amplio número de copias de genes CBCAS y otros genes similares a CBDAS (CBDAS-like, que sumamos al estudio y que no se sabe aún que cannabinoides producen), independientemente de que posean THCAS o CBDAS. Hemos detectado hasta 9 copias de CBCAS o CBAS-like en un genoma haploide (el promedio de copias que habría en un solo cromosoma, de los dos del par). Al contrario de THCAS y CBDAS, se vió que tanto CBCAS como CBDAS-like se exprean muy poco en flores. Al considerar el análisis del conjunto de todas las cannabinoides sintasas en diferentes variedades de Cannabis, hemos visto que existe una gran variación en el número de copias de estos genes en las diferentes variedades, habiendo detectado entre 4 y 16 copias de estos genes por genoma haploide (promedio por cromosoma, de los dos del par). Todos estos hallazgos indican que hay cannabinoides sintasas en los genomas que no se sabe que producen y podrían ser responsables de diferencias en el perfil de cannabinoides minoritarios en las diferentes variedades de Cannabis. Estos cannabinoides podrían ser responsables del “efecto séquito”, y por tanto de interés a la hora de estudiar el uso de las diferentes variedades. Utilizando el mismo método desarrollado en este proyecto, se analizó una población de plantas hermanas, derivadas de un cruce entre una planta rica en THC (Skunk) y una planta THC:CBD balanceadad (CBD-crack), para estudiar en más detalle la distribución en los cromosomas y la herencia de los genes que codifican a las cannabinoides sintasas (además de verificar la precisión del método desarrollado). El estudio mostró muy buena precisión al estudiar el número de copias de los genes estudiados en las plantas hermanas. A nivel de los parentales, mostró que los genes segregan de forma Mendeliana. Además, permitió inferir que Skunk posee una THCAS en cada uno de sus cromosomas y que CBD-crack posee un gen THCAS en un cromosoma y un gen CBDAS en el otro. Además, mostró que ambos parentales poseen uno de sus cromosomas sin genes CBCAS, por lo que las CBCAS segregan en la población de hijas, habiendo hijas sin genes CBCAS e hijas con el doble de genes de CBCAS que los parentales. Este hallazgo puede ser de interés para estudiar el papel de las CBCAS o CBDAS-like en la producción de cannabinoides menores. También es interesante al pensar en planes de mejora genética en donde CBCAS puede ser de interés conservar o eliminar, dada su capacidad de producir CBC. Sin duda, dada la gran variación en el número de cannabinoides sintasas que hemos demostrado existe en las diferentes variedades de Cannabis, y entre cromosomas, el método desarrollado es útil para la caracterización de variedades y para asistir planes de mejora genética enfocados en la producción de cannabinoides.