Caracterização genética de Listeria monocytogenes e Listeria innocua isoladas de casos clínicos em bovinos e pequenos ruminantes no Uruguai

Abstract

O objetivo deste trabalho foi realizara caracterização genética de isolados de Listeria recuperados de casos de neurolisteriose (19) e aborto (1) em ruminantes diagnosticados entre 2014-2022. Foram analisados 16 isolados de L. monocytogenes (7 de bovinos, 8 de ovinos e 1 de caprino) e 4 isolados de L. innocua (3 de bovinos e 1 de ovino). A extração do DNA bacteriano foi realizada com o kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen®), seguindo as instruções do fabricante. O sequenciamento foi realizado com o equipamento Illumina MiniSeq para gerar leituras pareadas de 150 pb utilizando o kit de preparação de bibliotecas Nextera XT DNA library preparation kit (Illumina®). Os dados foram analisados utilizando a plataforma BaseSpace® Sequence Hub, usando o aplicativo SPAdes versão: 3.9.0 para a montagem de novo e Prokka Genome Annotation BaseSpace App (versão 1.11.1) para a anotação do genoma. Os arquivos gerados foram enviados para o banco de dados do Institut Pasteur da França (BIGSdb-Lm: https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/), para corroborar a espécie de Listeria atribuída por meio de testes bioquímicos e classificar geneticamente os isolados de acordo com MLST e cgMLST. A análise através do MLST mostrou que os isolados de L. monocytogenes foram agrupados em 7 complexos clonais (CC) distintos, sendo o CC1 o mais frequente (7/16, 43,75%). Dois isolados foram caracterizados como CC4 (12,5%), outros dois como CC7 (12,5%) e outros dois como CC489 (12,5%). Por fim, um isolado foi caracterizado como CC224 (6,25%), outro como CC2549 (6,25%) e outro como CC288 (6,25%). Este resultado é semelhante a outros trabalhos que estudaram a diversidade genética de L. monocytogenes em casos animais e humanos na Europa ou América do Norte, onde se registra uma predominância do CC1. As cepas do CC1, assim como as do CC6, são classificadas como "hipervirulentas" e estão significativamente associadas a casos de listeriose em humanos e em ruminantes. Neste estudo, as cepas “hipervirulentas” foram detectadas em bovinos e ovinos com sinais neurológicos.Com relação à análise do genoma por cgMLST, foram identificados 15 CTs distintos, o que mostra uma ampla variabilidade genética. Interresantemente, dois isolados de L. monocytogenes recuperados de casos em ovinos do mesmo estabelecimento, mas em anos diferentes (2017 e 2018), apresentaram o mesmo CT. Isso indica que a mesma cepa ambiental afetou os ovinos em anos diferentes. Os quatro isolados de L. innocua recuperados de casos clínicos foram agrupados de acordo com o MLST em 3 CCs distintos (CC133, CC140 e CC448), mas não foram atribuídos a nenhum CT. Na literatura, são relatados poucos casos de listeriose por este agente, portanto é necessário continuar realizando isolamentos a partir de casos clínicos. Com base nestes resultados, podemos concluir que: 1) no Uruguai, os ruminantes são afetados principalmente por cepas "hipervirulentas" de L. monocytogenes; 2) considerando que os bovinos excretam Listeria assintomaticamente pelas fezes, estariam disseminando cepas virulentas que podem contaminar alimentos de origem animal; 3) a variabilidade genética de Listeria nos casos clínicos é ampla; 4) existem cepas persistentes no ambiente de propriedades agropecuárias.