Identification and characterization of Stemphylium species causing gray leaf spot of tomato in Uruguay.

Abstract

El tomate (Solanum lycopersicum L.) es un cultivo de gran importancia a nivel mundial y es el segundo cultivo hortícola más importante en Uruguay. Hongos del género Stemphylium, causan la mancha gris de la hoja del tomate, una enfermedad destructiva responsable de grandes pérdidas de producción en variedades susceptibles. En este trabajo nos planteamos identificar las especies de Stemphylium asociadas con la mancha gris de la hoja del tomate en Uruguay y evaluar la diversidad genética y agresividad de los aislados. Actualmente contamos con 36 aislados provenientes de hojas de tomate con síntomas de diferentes departamentos del país, incluyendo Salto, Artigas, Montevideo y Canelones. Mediante la amplificación de la región espaciadora del transcrito interno (ITS) y de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (gpd) y posterior secuenciación y comparación con secuencias de diferentes Stemphylium depositadas en el NCBI, pudimos determinar que 3 aislados corresponden a S. vesicarium y los restantes 33 a la especie S. lycopercisi, resultando ser la predominante en el territorio Uruguayo. A su vez, realizamos amplificaciones con marcadores ISSRs (inter simple secuence repeat) para evaluar la diversidad genética de los 33 aislados de S. lycopercisi, obteniendo un dendograma que separa los aislados en 3 grupos. Se realizó una caracterización morfológica de los aislados y se analizó la velocidad de crecimiento, obteniéndose una gran diversidad dentro de S. lycopercisi con diferentes coloraciones de las colonias que van del negro o gris oscuro al amarillo o blanco. Los 3 aislados de S. vesicarium fueron muy similares en aspecto, presentando un color gris oliva con micelio aterciopelado. También se encontraron diferencias en la velocidad de crecimiento de los aislados, desde 2.11 cm a 3.6 cm de halo de crecimiento al cabo de 7 días. Mediante un análisis microscópico de los conidios producidos por cada aislado, observamos diferencia morfológica entre ambas especies, siendo los conidios de S. lycopercisi más finos y alargados, mientras que los de S. vesicarium son más compactos. A su vez, se pusieron a punto los ensayos de infección tanto en planta como en hoja desprendida. En los ensayos en hojas desprendidas de plantas de tomate susceptibles, se calculó el área con síntomas utilizando hongos representativos de los tres grupos obtenidos en el dendograma. Los resultados mostraron que los aislados UYSLS28, UYSLS29 y UYSLS32 de S. lycopercisi son muy más virulentos , mientras que UYSLS20 es significativamente menos virulento. Los aislados muy virulentos y el aislado menos virulento, pertenecen a grupos diferentes y se encuentran distantes en el dendograma. Además, los aislados más virulentos resultaron ser los de crecimiento más rápido en medio PDA. De los ensayos de infección se tomaron muestras de hojas a distintos tiempos (días post inoculación; dpi), las cuales fueron teñidas con solofenil para ver las esporas y las hifas del hongo, y con ioduro de propidio, para poder ver la estructura celular de la planta. Con éstas imágenes logramos observar la germinación de las esporas a 1 dpi, el crecimiento de las hifas iniciales a 2 dpi y su ingreso por estomas a 3 dpi. Incluso, pudimos observar a 5 dpi el engrosamiento de la pared celular característico de la respuesta de defensa de la planta. En estos ensayos se evidenció que el micelio del hongo UYSLS32 coloniza mucho más el tejido de la planta que el del hongo UYSLS20, lo cual se correlaciona con su nivel de virulencia. Por último, se evaluará la expresión de genes de S. lycopersici relacionadas con la patogenicidad durante la infección de hojas de tomate mediante qRT-PCR. Esto nos permitirá generar información sobre las bases moleculares de los mecanismos de virulencia en diferentes aislados.